美洲大赤魷

美洲大赤魷(DosidicusGigas)在食品加工過程中的軟骨廢棄物為原料,建立包括粉碎、脫水脫脂、酶解、除蛋白、醇沉、離子交換、脫鹽等操作流程的CS制備方法,制備得到新型CS。最終產品的產率達到16±2%。用商品化的硫酸軟骨素ABC酶、硫酸皮膚素酶、透明質酸酶(來自于StreptomycesHyalurolyticus)、以及實驗室自有產權的rHCLase降解所得多糖,根據酶的底物專一性,確認所制備的多糖為CS；通過咔唑反應檢測樣品中新型CS含量,BCA蛋白定量法檢測樣品中蛋白含量。結果提示：樣品中新型CS含量達到97%以上,蛋白含量低于2%。2.新型CS多糖結構的初步分析：參照葡聚糖分子量標準物,經凝膠過濾HPLC分析,確定所制備的NER-CS多糖平均分子量約為623.2 kDa。再通過硫酸軟骨素ABC酶完全降解,結合HPLC分析二糖組成,發現NER-CS主要含有GlcAβ1-3GalNAcGlcAβ1-3GalNAc(4S)、GlcAβ1-3GalNAc(6S)、E-unit,其中E-unit含量最高可達44.5%,同時GlcAp1-3GalNAc、GlcAβ1-3GalNAc(4S)]、GlcAβ1-3GalNAc(6S)]含量分別為7.1%、12.6%、35.8%,總硫酸化度為1.37。是一種新型高硫酸化CS。3NER-CS生物活性的初步分析：1)用Aglyco試劑盒檢測NER-CS的抗凝血活性,結果顯示：NER-CS抗FⅡa和抗FXa活性分別為20±2U/mg和0.9±0.2U/mg,是陽性對照肝素抗FⅡa活性的10%左右,抗FXa活性的4%左右；2)利用乳腺癌4T1細胞試驗轉移模型,分析NER-CS在小鼠體內抗腫瘤轉移活性,結果顯示：50、100和200μgNER-CS的抑瘤率分別為54.3±2.5%、75.1±3.5%、42.9±2.1%,同時陽性對照100μg肝素的抑瘤率為74.6±1.8%；3)用親和素修飾的CM5芯片固定生物素化NER-CS,分析NER-CS與五種生長因子、三種選擇素的相互作用活性,結果顯示NER-CS與生長因子HGF、bFGF相互作用活性較高,親和力常數分別為(3.47±1.73)x10-6、(5.39±2.92)x10-8。4.NER-CS寡糖的制備及其抗腫瘤活性分析。